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Nature | 冻龄女神！泛素化蛋白组发现抗衰老新机制

作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-25T18:22 (访问量:3030)

编者按

真核生物体内存在数万种蛋白，各自行使功能，且每种内源性蛋白都有规定寿命，行使完功能后发生降解。泛素化（Ub）是真核生物最普遍的蛋白降解途径之一，通过对蛋白进行泛素化标记，使其被细胞内相应的酶识别进而降解（此过程可被去泛素化酶DUB逆转）。以往研究证实泛素化几乎参与一切生命活动调节，但其对衰老的影响尚不清楚。

2021年7月，德国科隆大学Vilchez. David研究小组在Nature上在线发表了题为“Rewiring of the ubiquitinated proteome determines ageing in C. elegans”的研究论文，作者利用泛素化蛋白组学证实衰老期间去泛素化酶活性增加，导致泛素化水平整体丧失，进而出现随年龄增长发生的蛋白清除障碍和体内沉积。此外，作者发现通过基因干预或外源性药物加快蛋白分解，可显著延长线虫寿命。

【研究材料】

秀丽隐杆线虫（平均寿命19天）

野生型线虫模型（实验组）：初生时期Day1，青年时期Day5，中年时期Day10，老年时期Day15
长寿命线虫模型（对照组）：饮食限制以及胰岛素/IGF-1信号通路降低（年龄与野生型匹配）

【技术方法】

泛素化蛋白组学

实验方法简介
第1步：构建野生型和长寿的秀丽隐杆线虫模型，观察表型

第2步：对不同年龄组线虫进行泛素化蛋白组学检测，发现蛋白泛素化修饰层面差异

第3步：分析影响蛋白泛素化的直接因素（E3连接酶和去泛素化酶），锁定蛋白泛素化修饰程度差异背后原因

第4步：结合基因改造模型，筛选影响线虫寿命的关键蛋白酶体靶标

第5步：功能实验：揭示两种关键寿命决定因子（IFB-2和EPS-8）调控寿命的分子机制

研究结果

1. 衰老过程中的泛素化蛋白质组发生重塑

作者对不同年龄的野生线虫和长寿线虫模型进行泛素化蛋白组学分析，筛选到3373个泛素化修饰肽段（对应1485种蛋白），其中多种Ub肽段水平随年龄而发生变化。其中，老年野生线虫发生明显的泛素化修饰下调，而同年龄长寿线虫并未出现明显的泛素化修饰下调，反而伴随衰老出现泛素化修饰增加。作者进一步进行蛋白印迹分析，发现老年野生线虫体内泛素编码基因表达并未发生下调，表明泛素化水平差异并非由于泛素蛋白表达的差异，而是由于泛素化修饰发生丢失。

图1 随年龄增长，Ub蛋白质发生重构

2. 伴随年龄增长，去泛素化酶会减少蛋白泛素化

众所周知，E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs）是调控蛋白泛素化水平的直接因素。作者分别比较了两种酶的在不同组间的变化：

1) E3连接酶：线虫体内存在170余种E3连接酶，其中有12种在衰老过程中发生显著变化，占比7%；

2) 去泛素化酶：线虫体内存在45种去泛素化酶，其中有14种在老年野生型线虫体内发生明显上调，占比31%。

此外，作者发现基因敲除衰老过程中上调的去泛素化酶可改善衰老相关的泛素化修饰丢失，且使用DUB抑制剂RP-619可提高老年线虫体内泛素化水平，并延长其寿命。

图2 抑制失调DUB可改善老年野生型线虫Ub蛋白水平，延长平均寿命

3. 随着年龄的增长，蛋白酶体靶标降解受阻，影响线虫寿命

作者筛选出192种蛋白质，发现其在衰老过程中至少存在1个赖氨酸位点的泛素化程度减低，而蛋白质总表达水平增加。作者推测这种失衡的蛋白累积是由于泛素化水平降低阻碍了蛋白酶体的识别和降解。为证明上述假设，作者整合了蛋白酶体基因改造的年轻线虫和未经处理的老年线虫数据，从中鉴定出10种年龄相关的蛋白酶体靶标。其中HSP-43和USP5敲除导致线虫寿命缩短，其余8种蛋白（IFB-2、EPS-8、RPL-4、M01G12.9、C46C2.2、F54D1.6、DDI-1、LEC-1）敲除导致线虫寿命延长。

图3 年龄相关的去泛素化会损害长寿调节剂的靶向降解

令人兴奋的是，IFB-2和EPS-8敲除对线虫寿命的影响最大。为证实IFB-2和EPS-8中泛素化丧失与寿命调节的直接联系，作者通过生成赖氨酸（K）-精氨酸（R）突变体来阻断内源性IFB-2和EPS-8的泛素化。结果证实，与年龄相关的去泛素化和随后的IFB-2和EPS-8降解受损决定了线虫寿命。

图4 IFB-2和EPS-8水平增加会缩短线虫寿命

4. 寿命决定因子IFB-2和EPS-8生物学功能解析

IFB-2：作者发现仅在肠道中针对中间丝IFB-2的RNAi可延长寿命，而在其他组织中的RNAi则不影响线虫寿命。进一步分析发现，IFB-2和其他相互作用的中间丝蛋白形成富含中间丝的层-肠细胞顶端细胞质中的进化保守区域，对肠道形态发生和完整性至关重要。衰老状态下IFB-2的错误定位和聚集导致了肠道完整性的丧失（衰老的特征）。此外，ifb-2的敲低减少了老年线虫肠道中的细菌入侵，而无泛素化的IFB-2突变则加剧了上述表型。

图5 增加的 IFB-2 水平会引起与年龄相关的肠道改变

EPS-8：尽管EPS-8在不同组织中的水平均随年龄增长而增加，但它通过其在肌肉和神经元内的活动调节生物体寿命。作为胞内信号通路底物，EPS-8表达增加会过度激活RAC信号通路，进一步导致激酶JNK磷酸化升高，从而调节参与细胞存活和死亡的转录因子。此外，RAC还可促进肌动蛋白细胞骨架的聚合和重塑、增加其不稳定性，最终影响肌肉运动和活动能力。

图6 增加的EPS-8水平通过RAC过度激活缩短寿命

小结
研究人员发现，相比于长寿的秀丽隐杆线虫模型，野生型线虫随着年龄增长往往面临着蛋白质清除功能障碍问题，其本质是由于泛素化减少和降解缺失导致的蛋白酶体靶标蛋白累积。减少这些伴随年龄增长而增加的蛋白酶体靶标蛋白可延长寿命，反之则缩短寿命。此外，作者对蛋白酶体靶标进行分析，发现两种在衰老过程中缺乏泛素标记的蛋白，IFB-2和 EPS-8，并利用基因改造模型明确其参与的生物学功能。综上，本研究提供了有助于理解衰老和长寿的全面数据集，并发现两个潜在的抗衰靶标，为后续抗衰药物研发提供潜在理论基础。

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