上期我们解析了Cas蛋白家族的十八般武艺，其作为基因编辑的“剪刀”，在CRISPR系统中发挥着至关重要的作用。但Cas蛋白并不能单独完成精准的基因编辑任务，它需要一个精准定位的“导航系统”——向导sgRNA，来引领它到达基因组中的特定位置。本期我们将聚焦于sgRNA，对其进行详细解读，帮助各位科研伙伴精通、运用CRISPR/Cas9技术。
sgRNA（single guide RNA，小向导RNA），是基因编辑技术中的关键分子，由 crRNA（与目标DNA互补的CRISPR RNA）和tracrRNA（激活Cas9蛋白的反式激活crRNA）连接而成。
sgRNA组合图
sgRNA的前身源于2007年，法国科学家Rodolphe Barrangou等人在研究嗜热链球菌的过程中，发现当噬菌体感染嗜热链球菌后，嗜热链球菌会将噬菌体的DNA片段整合到其自身的CRISPR序列中，形成新的间隔序列。再次遭受同一种噬菌体的侵袭时，其CRISPR序列中的间隔序列会被转录成crRNA，crRNA与tracrRNA结合形成复合物，引导Cas9蛋白识别并切割噬菌体的DNA，从而使嗜热链球菌获得对该种噬菌体的免疫[1]。这一发现不仅首次证实了CRISPR-Cas系统在细菌中是一种获得性免疫机制，能够帮助细菌抵御外来病毒的侵害，也为后来sgRNA的设计打下了基础。
随后科学家们陆续鉴定出多种细菌和古细菌中的tracrRNA（反式编码的小RNA），适配不同的CRISPR系统。其中，最简单的系统是来自化脓性链球菌（S. pyogenes）的II 型 CRISPR 系统。最终，Jennifer与Emmanuelle根据crRNA和tracrRNA的双RNA结构引导Cas9蛋白定位特定位点的原理，设计将crRNA的3’端与tracrRNA的5’端融合成具有发夹结构的sgRNA，其证明，仅需设计crRNA 5’端20nt的氨基酸序列，与靶DNA结合，再通过tracrRNA激活Cas9蛋白，即可引导Cas9蛋白实现高效、精准的切割，构建了CRISPR/Cas9基因编辑系统[2]。
CRISPR/Cas9技术原理
设计sgRNA
要想进行CRISPR/Cas9基因编辑，sgRNA的设计是必不可少的。首先，需要确认靶DNA序列，即切割位点前存在特定的PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）——对常用的SpCas9蛋白而言，PAM为5'-NGG-3'（位于靶点下游3bp）。之后根据目标物种的编辑需求（基因敲除/敲入/碱基编辑），选择合适的Cas蛋白，如野生型SpCas9蛋白（Cat.No.:E365）、小体积SaCas9（Cat.No.:E372）等。
设计原则
1：sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt（靶基因匹配序列）。
2：sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列前，PAM序列的特征为NGG（N可以为任意核苷酸），所以选择3’末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。
3：sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。
4：如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5’碱基为G或GG，来提高其转录效率。
5：全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。
6：如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。
体外转录合成sgRNA
sgRNA设计完成后，即获得正向引物和反向引物，以DNA为模板，通过上下游引物互补配对扩增出双链DNA，再以双链DNA为模板，通过T7 RNA聚合酶或其他RNA聚合酶，体外转录合成sgRNA。之后通过DNaes I消化产物中的双链DNA模板，再通过纯化试剂盒获得纯化的sgRNA。
体外转录合成sgRNA步骤
体外转录合成 sgRNA 具有诸多优势，如在基因编辑实验中，尤其是对于受精卵等需要快速起效的场景，可提前制备好sgRNA，使基因编辑尽早进行，提高实验效率。相比在细胞内表达sgRNA的方式，体外合成的sgRNA更能精确控制其浓度和质量，从而优化基因编辑的效果，减少不必要的副反应。此外，该方法适用于多种细胞类型，且合成过程相对灵活可控，可根据具体实验需求进行调整。
市面上已经有很多体外转录试剂盒，但存在操作步骤繁琐、sgRNA产量低等问题。近岸蛋白新推出的产品，通用型一步法sgRNA体外转录试剂盒（Universal sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit，Cat.No.:E399），能够一步体外高效转录sgRNA片段，除可合成常见的Cas9 sgRNA以外，还可合成其他具有更高基因组编辑效率和更低脱靶率的Cas蛋白sgRNA（如：Cas12a、Cas12b、Cas13a等），20μl体系sgRNA产量可达10-30μg，适配不同种类的sgRNA，高效助力基因编辑！
通用型sgRNA体外转录实验流程
需注意，不同Cas蛋白的引物设计原理不同，需根据选择的Cas蛋白调整引物的序列。
性能展示
适配多类型Cas蛋白的sgRNA，告别“换酶即换盒”
图例）体外转录不同类型Cas酶的sgRNA。结果显示，E399试剂盒适配多种类型Cas蛋白，转录效率高，产量高。
一步高效合成，效率与产量双赢
图例）E399体外高效转录sgRNA，扩增的sgRNA的浓度及产量均高于其他产品。
在CRISPR-Cas9系统中，Cas蛋白是切割DNA的分子剪刀，而sgRNA则是精准制导的导航系统。只有sgRNA与Cas蛋白相互协作，才能实现对目标基因的精准编辑。那么sgRNA和Cas蛋白两个核心组件已经整装待发，是时候进入细胞启动基因编辑，下期近岸蛋白将详细解析CRISPR/Cas系统运送到细胞的各种转染技术，下期不见不散！
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RNA体外转录试剂盒产品推荐
| 类型 | 定位 | 目录号 | 产品名称 |
| RNA体外转录 | 通用型体外转录sgRNA | E399 | Universal sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit |
| 一步法体外转录sgRNA | E369 | sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit | |
| T7 RNA聚合酶转录 | E131 | T7 High Yield RNA Transcription kit |
参考文献
[1]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes [J]. Science, 2007, 315 (5819): 1709-1712.
[2]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I M, et al. A programmable dual - RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science, 2012, 337(6096): 816 - 821.